Progetto Nabruka: le caratteristiche

Dal documento di presentazione progetto elaborato dalla LILT Bergamo

 

Human Papilloma Virus mRNA nel triage delle lesioni cervico-vaginali in donne migranti temporaneamente residenti in Italia

 

Riassunto del progetto

Obiettivi: Negli ultimi anni i flussi migratori hanno determinato l’aumento di donne che per motivi di lavoro o ricongiungimento famigliare hanno raggiunto il nostro paese. L’elevata incidenza di migranti “irregolari” rende problematico impostare programmi assistenziali e di screening adeguati. L’attuale progetto di studio si prefigge lo scopo di offrire un programma di screening per patologie HPV-correlate a donne escluse  dai programmi tradizionali temporaneamente residenti nella provincia di Bergamo e valutare l’eventuale maggiore valore predittivo positivo per queste patologie del test E6/E7 HPVmRNA rispetto al Pap test e al test HPV DNA. La procedura per l’arruolamento prevede: anonimato, consenso informato, colloquio informativo e accettazione di brochure sulle malattie a trasmissione sessuale.

Metodi: L’analisi molecolare consta di due test: HPV DNA mediante Hybrid Capture assay e HPVmRNA mediante NucliSENSE assay.  Alla luce dei risultati ottenuti le donne potranno essere invitate a ripetere l’esame dopo tre anni, dopo un anno oppure essere sottoposte ad indagine colposcopica e eventuale terapia. In particolare si valuterà l’impatto del test HPVmRNA sul percorso diagnostico, al fine di stabilire se tale test potrà, in futuro, essere inserito da solo o affiancato a HPV DNA nella pratica clinica.

Salute Pubblica: il progetto offre a donne migranti “irregolari” uno screening primario per il carcinoma cervicale e il triage secondario per quelle a rischio di sviluppare (o portatrici di)  SIL ad alto grado. Lo studio, in linea con quanto previsto dal D.L. 25/07/1998, costituisce uno strumento idoneo per diffondere la cultura della prevenzione di una delle principali malattie a trasmissione sessuale e della patologia tumorale tra donne che spesso vivono malattie in cui l’esclusione stessa dalla diagnosi tempestiva svolge un ruolo prognostico negativo. Dall’analisi dei dati, si otterranno informazioni utili sulla prevalenza dell’infezione in questo gruppo di persone e indicazioni sulle eventuali misure di profilassi da instaurare.

Background e razionale

Il carcinoma della cervice è il tumore maligno ginecologico più frequente al mondo e la seconda forma tumorale maligna nella donna; la sua incidenza stimata è di circa 500.000 casi all’anno (1). Esistono differenze drammatiche tra paesi in cui esiste un’attenta assistenza sanitaria e programmi di screening con Pap test e alcuni paese dell’America latina, della zona Caraibica e dell’Africa dove il carcinoma della cervice è la più comune causa di morte per cancro nella donna (2). E’ ampiamente condivisa l’ipotesi che l’incidenza del carcinoma cervicale sia correlata all’attività sessuale e in particolare all’età dei primi rapporti, a partners multipli, a storie di infezioni veneree. Negli Stati Uniti, donne a basso livello socio-economico Ispaniche o Colorate hanno maggiore incidenza di malattia: i tassi di incidenza sono stimati in 8,1/100.000 nuovi casi all’anno per le donne bianche, 11/100.000 nelle Colorate e 14,4/100.000 nelle  ispaniche (2).In Italia i dati dei registri tumori dal 1998 al 2002 dimostrano che ogni anno sono stati diagnosticati 3500 nuovi casi di carcinoma della cervice; l’incidenza è di 10 casi per 100.000; più di 1000 donne muoiono ogni anno in Italia per questa patologia (3). Nel corso della vita il rischio di avere una diagnosi di carcinoma della cervice è del 6,2 per 1000 (1 caso ogni 163 donne) mentre il rischio di morire è di 0,8 per 1000. Sia l’incidenza che la mortalità  tendono a diminuire nel tempo (3). Considerati i tempi lunghi per la progressione verso il carcinoma, acquistano  grande importanza i programmi di screening che consentono di identificare lesioni precancerose e di intervenire prima che evolvano in carcinoma. Nel corso degli ultimi anni i flussi migratori hanno determinato una maggiore presenza di donne migranti nel nostro paese,  per motivi lavorativi e per ricongiungimento familiare. La  presenza di migranti irregolari  rende estremamente difficile impostare programmi sanitari adeguati (4). Meritevoli istituzioni pubbliche e private cercano di fornire risposte adeguate ai bisogni di salute degli stranieri temporaneamente residenti. Particolare attenzione deve essere posta alla prevenzione, diagnosi e terapia delle malattie sessualmente trasmesse a alla diagnosi delle patologie HPV correlate. Attualmente i programmi di screening sono fondati sul Pap test associato o meno al test molecolare per la rivelazione di HPV e del suo genotipo. L’adozione di metodiche di screening dotate di un elevato valore predittivo positivo può rappresentare un elemento importante per identificare rapidamente le pazienti con patologia evolutiva e sottoporle all’esame colposcopico e alla terapia. Recenti meta-analisi hanno dimostrato che l’accuratezza del Pap test varia notevolmente con valori di sensibilità tra il 30 e l’87%(5,6). Vista l’elevata incidenza di Pap test falsi-negativi e il  suo impatto sulla salute pubblica, si sono attivati importanti studi che hanno dimostrato che il test molecolare per HPV DNA ha maggiore sensibilità del Pap Test nel rilevare la neoplasia cervicale intraepiteliale (5,6). Questa lesione si sviluppa con la necessaria presenza di genotipi ad alto rischio di HPV (HR-HPV), ma l’espressione degli oncogeni E6-E7 di HPV è necessaria per il mantenimento del genoma virale, la proliferazione cellulare e la progressione tumorale della malattia (7). Pertanto determinare la presenza di E6/E7 mRNA di HR-HPV potrebbe servire a identificare le pazienti effettivamente a rischio di sviluppare il tumore. Questo studio si propone di valutare se il test HPVmRNA possa rappresentare per le donne migranti uno strumento di triage di patologia cervicale più sensibile rispetto al Pap Test associato al test molecolare per HPV-DNA

Metodologia del progetto

Studi epidemiologici e molecolari hanno dimostrato che la correlazione tra attività sessuale e carcinoma cervicale è dovuta alla trasmissione del virus epiteliotropico e oncogenico HPV (virus del papilloma umano) (1). Il carcinoma cervicale è il primo tumore ad essere riconosciuto dall’Organizzazione Mondiale della Sanità come completamente riconducibile alla infezione HPV (8)

Ad oggi sono identificati oltre 120 genotipi di HPV che infettano l’uomo e, tra questi, circa 40 sono associati a patologie del distretto ano-genitale. I diversi genotipi vengono distinti in “basso” ed “alto” rischio di indurre trasformazione neoplastica: quelli a basso rischio sono associati a lesioni benigne come i condilomi ano genitali, mentre quelli ad alto rischio sono implicati nella patogenesi del carcinoma cervicale, del carcinoma del pene, della vagina, dell’ano.

I genotipi virali ad alto rischio più frequentemente associati a carcinoma della cervice sono il 16 e il 18, responsabili complessivamente di circa il 70% dei carcinomi cervicali (9).

La storia naturale dell’infezione che è condizionata dall’equilibrio tra ospite e virus infettante, può seguire tre diverse forme: regredire, persistere o progredire. Si calcola che il 70-90% delle infezioni sia transitoria, con una pronta eliminazione del virus prima che questo possa sviluppare il suo effetto patogeno (9): la persistenza dell’infezione da HPV ad alto rischio, può essere influenzata dal fumo di sigaretta, dalla co-infezione con altri patogeni sessualmente trasmessi e dall’elevato numero di partners (10). Per questi motivi i programmi di screening svolgono un importante ruolo preventivo: nel territorio bergamasco della Valle Cavallina dove è attivo un programma di screening della popolazione femminile dal 1989, a cura della Lega Italiana per la Lotta contro i Tumori, il tasso standardizzato di mortalità per tumore dell’utero è di 0,09, rispetto ad una media provinciale di 0,84 (11)

La presente proposta riguarda uno studio cross-sezionale di una popolazione di donne di età compresa tra i 30 e i 55 anni liberamente afferenti nell’arco di 24 mesi nell’ambulatorio Ostetrico Ginecologico dell’ASL della Provincia di Bergamo e nell’Ambulatorio Ostetrico Ginecologico di Oikos Onlus. Tutte le donne che parteciperanno al progetto dovranno compilare un  questionario che verrà mantenuto anonimo e che riporterà i seguenti dati:

•   Età
•   Livello scolare
•   Provenienza
•   Tempo di permanenza in Italia
•   Tipo di lavoro prestato in Italia,
•   Età al menarca
•   Età del primo rapporto sessuale
•   Numero di figli
•   Se fumatrice quante sigarette al giorno e da quanto tempo.

Il questionario fornirà elementi epidemiologici utili alle organizzazioni sanitarie e sociali che cooperano al presente studio e dati importanti al fine di impostare successivi studi comparativi con la popolazione italiana.

A loro richiesta e previa informazione dello studio in corso e dopo aver acquisito la sottoscrizione del modulo per il consenso informato, personale qualificato  (ostetriche diplomate) eseguirà prelievo ambulatoriale cervicale per PAP Test tradizionale e prelievo per test molecolare HPV DNA e HPV mRNA. Il preparato citologico e il prelievo per lo studio degli acidi nuclei virali dovranno pervenire in double-bag da noi fornita entro due giorni presso il servizio di Anatomia Patologica degli Ospedali Riuniti di Bergamo, accompagnati da una scheda  riportante i dati seguenti:

•   Generalità criptate e acquisite in sede di intervista precedente il prelievo
•   Data dell’ultimo esame citologico ed eventuale esito dello stesso
•   Data dell’ultima mestruazione
•   Se gravidanza in corso
•   Se portatrice di IUD
•   Se sono presenti perdite ematiche atipiche e se sì da quanto tempo
•   Se in anamnesi sono presenti interventi chirurgici ginecologi e se sì di che tipo
•   Se è in corso terapia ormonale e se sì specificare quale
•   Se è stata o è  somministrata terapia radiante o chemioterapia, se sì per quale causa

Nella stessa sede la paziente dovrà sottoscrivere consenso informato riguardante la protezione dei dati personali (D.lgs. n. 196 del 30-6-2003) e l’uso dei dati ottenuti dallo studio .

La donna riceverà una brochure redatta in italiano, inglese, francese, spagnolo, russo, rumeno e arabo che la informerà sulle possibilità, i limiti e le modalità del programma di screening . Nella stessa brochure verranno riportate semplici misure di profilassi della malattie a trasmissione sessuale.

I tempi di risposta non saranno superiori ai venti giorni per offrire alle pazienti in cui verrà riscontrato un Pap test con SIL ad alto grado, la possibilità di ottenere nell’ambito dei Servizi ambulatoriali dell’Ospedale un adeguato approfondimento diagnostico e la eventuale terapia necessaria.

Al momento della consegna del referto, il medico volontario dell’organizzazione sociale a cui la donna è afferita avrà un colloquio con la paziente e le illustrerà i percorsi successivi in funzione dello schema seguente:

Pap test borderline (ASC-US o LSIL) e HPV DNA positivo : esame colposcopico

Pap test positivo per H-SIL con HPV DNA con qualsiasi esito: esame colposcopico

Pap test borderline e HPV DNA negativo: controllo entro un anno

Pap test negativo e HPV DNA positivo : controllo entro un anno

Se l’impatto dello studio sarà favorevole in termini di servizio offerto, si proporrà un convenzionamento diretto delle organizzazioni sociali a cui si riferiscono le donne con gli Ospedali Riuniti di Bergamo. Tale convenzione potrà essere sostenuta da finanziamenti richiesti sulla scorta dei dati ottenuti da questo progetto pilota.

Metodica

Campioni endo ed esocervicali verranno prelevati con spazzola per prelievo citologico (Cervex Brush, ROVERS Madical Devices B.V. Oss-NL) con la quale si allestirà lo striscio tradizionale fissato con Cytospray (Bioptica, Milano, I), quindi la spazzola verrà agitata nel contenitore con la soluzione PreservCyt (Cytec Corp, Boxborough, MA,USA) e destinato agli esami molecolari.

Il test per HR-HPV (genotipi 16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68) verrà eseguito con l’Hybrid Capture II assay (Digene, Garithersburg, MD, USA) secondo le istruzioni del produttore. I risultati verranno forniti come rapporto tra Relative Lights Units (RLU) e la soglia positiva del test definita a 1.0 pg of HPV DNA/ml. La performance di questo test è equivalente a quella dei protocolli di riferimento per la rivelazione in PCR di HPV su campioni ad uso clinico e la sua sensibilità analitica è di 0,2 pg di HPV DNA pari a circa 20.000 equivalenti genomici di HPV (12). L’ mRNA totale varrà estratto usando l’Rneasy Miniprotocol (Quiagen, Valencia, CA, USA). L’identificazione individuale dei trascritti di E6/E7 mRNA da HPV 16,18,31,33 e 45 verrà eseguito con l’assay NucliSENS HPV (Biomerieux, F) secondo le istruzioni del produttore. Oligonucleotidi standardizzati, corrispondenti alla sequenza virale, verranno inclusi come controllo positivo per ciascun genotipo virale. Per evitare risultati falsi negativi dovuti alla possibile degradazione dell’RNA, un set di primer e una sonda diretta contro la piccola ribonucleoproteina umana U1 (sn RNP) proteina specifica A (U1AmRNA) verranno usate come controllo di performance. La sensibilità analitica di NucliSENS è inferiore a 10 cellule SiHA equivalenti a 20 copie di HPV 16 e a meno di 1 cellula HeLa equivalente a 25 copie di HPV 18. La sensibilità analitica è basata sul random testing di vari tipi di HPV; nessuna cross reattività è stata dimostrata tra HPV 6,11,16,18,31,33,35,39,45,51,52 e 58 (13).

Analisi ulteriori in PCR e sequenziamento verranno eseguite nei seguenti casi:

a) Pap Test negativo o con lesione squamosa intraepiteliale a basso grado (L-SIL), test HPV DNA positivo e test mRNA negativo

b) Pap test con SIL ad alto grado, test HPV DNA positivo e mRNA negativo

c) Pap test con SIL ad alto grado ed entrambe i test molecolari negativi.

L’analisi di sequenza verrà eseguita su prodotti di PCR ottenuti usando i “consensus primers” Gp5+/6+ e Cpl/CpllG (14,15). Un’aliquota del prodotto di PCR verrà sequenziata con il metodo “chain-termination” di Sanger, in cui la reazione di sequenza con DNA sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA,USA) avverrà usando i primers di PCR come primers di sequenza. I prodotti della reazione verranno analizzati con ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). L’identificazione delle sequenze sarà eseguita con software per analisi di sequenza Ominga (Accelrys, San Diego, CA, USA) in funzione dell’NCBI Sequence Database.

Analisi citologica

Tutti i Pap test verranno studiati da citotecnici esperti operanti nell’USC di Anatomia Patologica dell’A.O. Ospedali Riuniti di Bergamo, dove da oltre 20 anni vengono esaminati più di 20.000 Pap test /anno. I referti verranno compilati secondo i criteri del sistema Bethesda (16).

Diagnosi istologica

Tutti i casi di SIL verranno proposti per esame colposcopico ed eventuale successiva conizzazione. Le lesioni istologiche verranno classificate secondo lo schema WHO (17)

Analisi statistica

L’associazione tra le variabili categoriche verrà valutata con il test Chi-quadro (Pearson, associazione lineare e test di McNemars) e il coefficiente Kappa. Le differenze tra gruppi indipendenti verranno sottoposte al test di Mann-Whitney. I dati verranno analizzati con un software SPSS (versione 11.5).

 

Obiettivi del progetto

Attualmente i programmi di screening sono fondati su PAP test associato o meno al test molecolare per la rivelazione di HPV e del suo genotipo. A tali programmi accedono con facilità le donne residenti, ma le donne migranti “irregolari” ne sono escluse. Nel presente studio si valuterà l’impatto di tre metodiche di screening su una popolazione di donne migranti irregolari afferenti spontaneamente al consultorio Ostetrico Ginecologico dell’ASL di Bergamo e all’ambulatorio OIKOS Onlus di Bergamo. Si prevede di poter reclutare da 700 a 1000 donne per anno per due anni.

Gli obiettivi del progetto  sono:

1)   Offrire la possibilità di screening per la prevenzione del tumore della cervice dell’utero a pazienti escluse dalle campagne di prevenzione tradizionali

2)   Valutare il valore predittivo positivo del test HPVmRNA nei confronti di una metodica ampiamente in uso

3)   Rivalutare l’accuratezza diagnostica del Pap test verso metodiche molecolari

4)   Identificare i genotipi di HPV DNA non compresi nel pool diagnostico Nuclisense

5)   Valutare se il presumibilmente ridotto numero di campioni positivi per mRNA sia correlabile a maggiore specificità analitica nei confronti di HPV DNA

6)   Valutare se il test mRNA sia sufficientemente specifico per condizioni precancerose o cancerose e possa nel futuro essere usato come metodica “stand alone” o essere associato a Pap test e/o HPV DNA

7)   Valutare se eventuali casi DNA positivi e mRNA negativi rappresentino veri falsi negativi del test mRNA o infezioni latenti o transitorie da controllare con follow up

8)   Valutare con analisi di sequenza se test mRNA positivi e DNA negativi siano risultati falsi positivi da cross reazione con genotipi non valutabili con il test HPV DNA usato

9)   Valutare se alla luce dei dati ottenuti l’analisi del rapporto costo/benefici del test mRNA  sia favorevole alla sua introduzione nella pratica clinica sostituendo o, più verosimilmente affiancando il test a DNA

 

 

Bibliografia essenziale

 

1)   Russel AH et al. Cancer of the cervix, vagina and vulva; in Clinical Oncology, Abeloff MD ed, Churchill Livingstone 2004; 2217-2271

2)   National Institute of Health Consensus Development Conference Statement: Cervical Cancer. April 13, 1996. J Natl Cancer Inst Monogr 1996; 22:vii

3)   AIRT working group. I tumori in Italia: rapporto 2006. Incidenza, mortalità, stime. Epidemiologia e Prevenzione 2006; (1) S: 64-65

4)   Caritas di Roma. Dossier Statistico Immigrazione 2003. Roma 2003

5)   Naucler P, Ryd W, Tornberg S et al. Human Papillomavirus and Papanicolaou tests to screen cervical cancer. N Engl J Med 2007; 357: 1579-1588

6)   Mayrand MH, Duarte Franco E, Rodrigues I et al. Human Papillomavirus DNA versus Papanicolaou screening test for cervical cancer. N Engl J Med 2007; 357: 1579-1588

7)   zur Hausen H, De Villers EM. Human Papillomaviruses. Annu Rev Microbiol 1994; 48:427-447

8)   Bosch FX, Lorinc A, Munoz N et al. The casual relation between human papilloma virus and cervical cancer . J Clin Pathol 2002; 55:244-265

9)  Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM et al. Human papillomavirus is necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 1999; 189:12-19

10) IARC Working Group. Human Papillomaviruses. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risk to humans; vol.64. Lyon. International Agency for Research on cancer; 1995

11) ASL della provincia di Bergamo: La mortalità oncologica in provincia di Bergamo, anni 1995-2003 ;pp79-81

12) Davies P, Kornegay J, Iftner T., Current methods of testing for human papillomavirus, Best Pract. Res. Clin.Obstet. Gynaecol., Volume: 15, pp 677-700

13) Lie AK, Risberg B, Borge B et al. DNA-versus RNA-based methods from human papillomavirus detection in cervical neoplasia. Gynecol. Oncol. 2005; 97(3): 908-915

14) De Roda  Husman AM, Walboomes JMM, Meijer CJLM et al. The use of general primers GP5+ and GP6+ elongated at their 3’ends with adjacent highly conserved sequences improves human papillomavirus detection by PCR, J. Gen. Virol., Volume 76, (1995), pp 1057-1062

15) Tieben L.M., Ter Schegget J., MinnaarR.P., Bouwes Bavinck J.N. Berkhout R.J. Vermeer B.J., et al. Detection of cutaneous and genital HPV types in clinical samples by PCR using consensus primers. J. Virol. Methods, Volume: 42, (1993), pp 265-279

16) Solomon D., Davey D., Kurman R. et al. The 2001 Bethesda System: terminology for reporting results of cervical cytology. JAMA 2002; 287: 2114-2119

17)World Health Organization Classification of Tumors. Tumors of the breast and female genital organs. Tavassoli F and Devilee P, eds IARC press, Lyon 2003. Pp 262-283